OMIP:ヒト骨髄造血および骨髄性新生物の分析 | Carballo Calero

背景

造血は、系統特異的マーカーの欠如およびKIT(CD117)およびCD34共発現(6、7)によって同定された共通の多能性造血幹細胞(HSC)からすべてのタイプの血液細胞が生じるプロセスである。 CD133およびCD38を用いてhscのより未熟なサブセットを同定することができるが(8,9)、系統−CD117+CD34+細胞は、多能性の可能性を保持する前駆表現型の最も成熟したグループを包含し、これらの細胞のさらなる分化は、5つの造血系統のうちの1つを下に進行する:赤造血、リンパ造血、骨髄造血、顆粒造血、または巨核球造血(10)(図1A)。 コミットされると、各系統の前駆細胞は、成熟した表現型へのますます制限された段階的な進行を識別するために使用することができる細胞表面マー これらの系統のうち、骨髄造血は、それが生じることができる完全に分化した表現型の多様性、およびその中の多数の分岐点およびサブセット(11)に関 したがって、フローサイトメトリー分析は、造血、特に骨髄造血の研究における主力である。

このOMIPを用いた骨髄単核細胞の分析。 (A)健康な骨髄単核細胞のためのゲーティングスキーマの例。 単一セルは、前方散乱高さ対幅パラメータ、続いて側散乱高さ対幅パラメータを使用してゲート化された。 Cd3+およびCD19+細胞と共に死んだ細胞を、その後のゲーティングスキームの前に分析から除外した。 ゲートは蛍光灯に合わせて設置された。 赤い矢印=ゲートセル。 ローマ数字のマーカーは、パートBの回路図に対応しています。(B)このパネルで分析された主要な造血系統の回路図の概要。 ローマ数字は離散的な表現型を示します。 (C)健康な骨髄単核細胞上のCD1 5、CD3 2、CD3 6、およびCD1 6 3染色を示すヒストグラム(黒色)、およびCMMLを有する2人の患者(赤色=患者1;青色=患者2)。 パートCの細胞は、最初にパートAのようにFSC特性対SSC特性にゲートダウンされた。

骨髄コンパートメントから発生する癌は、それらの元の細胞型の反射表面マーカーの多くを保持するだけでなく、他の骨髄マーカーまたは系統タイプ(の異常な発現を取得し、同様に賢明な複合体である1、2)。 免疫表現型MNsは診断のために重要であり、特に明確に管理される骨髄性およびリンパ性白血病の層状化に重要である。 骨髄異形成症候群(MDS)を含むMNsは、急性骨髄性白血病(AML)への移行リスクが増加し、生存率が低い異質な疾患群である(2)。

MNsの評価は、骨髄吸引液の形態学的評価に大きく依存しており、一連の低パラメータのフローサイトメトリパネルが並列または連続して実行されます(3、4)。 このようなパネルは、2008年にMdsにおけるフローサイトメトリーの標準化に関する国際ワークショップによって標準化されたセットとして最初に概説された。 残りのパラメーターは、系統マーカー CD2、CD5、CD7、CD1 0、CD1 9、CD1 4、CD1 5、CD1 6、CD5 6、および/またはcd1 1Bによって占有されていた。各管が特定の疾患サブセットに焦点を当てているようなcd71(3)。 最近では、EuroFlowコンソーシアムは、臨床的または実験室の適応症に基づいて選択されたいくつかのスクリーニングパネルのいずれかから始まる進歩的な方 MNsに関しては、この最初のスクリーニングパネルの結果は、それぞれB細胞、T細胞、または骨髄細胞に関連するマーカーを使用して、B細胞前駆体、急性リンパ芽球性白血病、またはAML/MDS疾患サブセットに焦点を当てた三つのより包括的なパネルセットのいずれかにそれぞれのケースを向けるだろう。 最初のスクリーニングパネルと一緒に設定されたAML/MDSパネルを考慮すると、EuroFlowコンソーシアムの勧告は、MNsケースのための36のマーカーを包含する(4)。

ここで提示されたパネルには、hscから成熟単球/マクロファージ集団、骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)、およびmds/MPN疾患サブタイプ(2、12、13-15)の広いスペクトルを単一の18色のパネル(表2)を介して骨髄造血の広範な概要を可能にするフレームワークが含まれている。 パネルは、最初に各抗体の染色希釈液を滴定し、最適な染色指数を計算し(補足図1および2)、次いで、パラメータのカテゴリセット(表2)に基づいてパネ パネルは、造血集団を分析する前に成熟リンパ球集団および形質細胞をゲートアウトするために、生存率マーカー Live/Dead(商標)Aqua(Thermofisher Scientific)と同じ検出器で分析から除 同様に、赤血球造血系および巨核球造血系は、それぞれCD7 1およびCd4 1Aを使用して骨髄系から分離することができ、その中のコミットされた前駆体は、CD1 1 7、またはCD4 5、CD3 4、およびCD1 1 7の組み合わせを使用して同定することができる。 Cd4 1A−CD7 1−細胞内で、コミットされていないHSCは、CD4 5+またはCd4 5Low細胞、次いでCD3 4+CD1 1 7+細胞、次いで最終的にCD3 3−HLA−DR−細胞上でゲーティングするこ 逆に、多能性前駆細胞(MPP)および共通骨髄前駆細胞(CMP)は、CD64発現を使用して、対応するCD33+HLA-DR+ゲート内のコミットされた単芽細胞から区別することがで 一般的なリンパ系前駆細胞(CLP)は、CD34+CD117−(11)として同定することができるが、より成熟したリンパ球集団は、生存率マーカーとともに一般的な”ダンプゲート”の一部 より成熟した単球および顆粒球の集団は、CD3 4ゲート内で分析することができる。 ここで、成熟単球は、CD1 4発現によって同定され得るが、前単球は、CD1 1 7−細胞上でゲーティングした後、CD3 3+CD6 4+HLA−DR+およびCd1 1C+として同定され得る。 顆粒球成熟の階層は、まず、CD1 1 7ゲート内のCD3 3−CD6 4−細胞上でゲーティングすることによって、次いで、Cd1 1Blow細胞上でCD1 6発現を増加させることによっ 最後に、完全に成熟した好中球を、SSCおよびCD4 5発現を使用してバンド細胞と区別することができる(図1B、補足表3)。 重要なことに、ここで染色された試料は、多くの患者の骨髄生検が行われるように、骨髄単核細胞(BMMNC)を得るために密度勾配遠心分離によって処理された。 標準的な方法ではあるが、この方法論は、成熟好中球のような多形核細胞を除外する。 RBC溶解などの代替試料処理は、所望であれば、これらの集団を保持することができる(補足図4)。

表2:

Reagents

Specificity Clone Fluorochrome Purpose Category
CD138 MI15 APC-Cy7 Plasma Cell Utility
CD19 HIB19 BV 510 Dump Utility
CD3 SK7 BV 510 Dump Utility
CD45 HI30 BUV 805 Leukocyte Utility
Live/Dead Aqua Viability Utility
CD117 104D2 BB 515 Progenitor Lineage
CD11b ICRF44 BV 650 Myeloid Lineage Lineage
CD11c 3.9 PE-CF594 Dendritic Cell Lineage
CD14 M5E2 BV 786 Monocyte Lineage
CD16 3G8 BUV 496 FC Receptor Lineage
CD33 WM53 BV 421 Myeloid Lineage Lineage
CD34 581 PE-Cy7 Progenitor Lineage
CD36 CB38 PerCP-Cy5.5 M2 Mac. サブセット
CD64 10.1 BUV737 活性化;M1 Mac。 サブセット
HLA-DR G46-6 BUV395 M1 Mac. サブセット
CD15 W6D3 AF700 骨髄成熟 疾患Diff.
CD163 GHI/61 BV605 マクロファージ 疾患Diff.
CD32 FUN-2 APC FC Receptor Disease Diff.
CD41a HIP8 PE Megakaryocyte Disease Diff.
CD71 M-A712 BV 711 Erythroid Marker Disease Diff.

BUV, Brilliant Ultra Violet™; PE, R-phycoerythrin; BV, Brilliant Violet™; Cy, cyanine; PerCP-Cy5.5, Peridinin-chlorophyll Cy-5.5; APC, allophycocyanin; Mac., macrophage; M1、I型マクロファージ;M2、II型マクロファージ;FC、フラグメント結晶化領域;Diff、分化

正常な造血系統の分類に加えて、CD15、Cd41A、およびCD71は、CD32およびCD163と組み合わせて、理論的には、MDSサブタイプの大部分とCMMLを含むさらなるサブ分画疾患サブセットを区別することができるMNsのいくつかのタイプを区別することができる重要なマーカーである(図1C、および補足図6-8)(16-22)。 このパネルの基本的な設計は骨髄系に焦点を当てているが、CD32やCD163などの疾患分化マーカーの代わりにCD38とCD45RAを含めることは、長期的なHSCとHSCサブタイプの分析に役立つ可能性がある(11)。

高次サイトメトリーでは、アルゴリズムガイド分析は、細胞表現型の予知を必要とする従来のゲートベースのアプローチに比べて、より包括的で客観的な分析オプションを提供します。 ここでは、密度正規化されたイベント(SPADE)のスパニングツリー進行分析を使用して、各パラメータの式に基づいて200個の異なるノードのいずれかにセルを割 これにより、37個の異なるノードクラスタ、または表現型が得られた(補足図9および10、補足表4)。 これらの表現型の三十は、ゲートベースの分析によって同定された集団に対応し、多くの場合、数値接尾辞によって注釈されたさらなるサブ集団を同定した(補足図10supplemental図4)。 スペードはまた、ゲートベースの分析によって同定された集団に対応していない七つの表現型を同定した。 ここでは示されていませんが、このパネルは、t-SNE/viSNE、Wanderlust、FlowSOM、またはPhenoGraph(24-26)を含むSPADEに加えて、他のアルゴリズムガイド解析に適しています。

要約すると、この最適化されたパネルは、骨髄造血に重点を置いた造血の研究に適しています。 このパネルは、骨髄コンパートメントの広い範囲にわたって表現型を区別することができるので、それは多数のMpnを特徴付けることができ、理論的にはCMMLを含むMDSサブタイプの大部分を、区別することができます。 また、特にSPADEなどのアルゴリズムガイド解析と組み合わせると、疾患サブセットをさらに層別化したり、その中に新しいバイオマーカーの組み合わせを定義したりすることにより、MPNsの研究を支援する可能性がある。

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