OMIP: Analyse der menschlichen Myelopoese und myeloischen Neoplasmen | Carballo Calero

Hintergrund

Hämatopoese ist der Prozess, bei dem alle Arten von Blutzellen aus einer gemeinsamen multipotenten hämatopoetischen Stammzelle (HSC) entstehen, die durch einen Mangel an abstammungsspezifischen Markern und durch KIT (CD117) und CD34-Coexpression identifiziert wird (6, 7). Während mehr unreife Untergruppen von HSC mit CD133 und CD38 identifiziert werden können (8, 9), umfassen Lineage−CD117 + CD34 + -Zellen die reifste Gruppe von Vorläuferphänotypen, die ein multipotentes Potenzial behalten, und die weitere Differenzierung dieser Zellen verläuft entlang einer von fünf hämatopoetischen Linien: Erythropoese, Lymphopoese, Myelopoese, Granulopoese oder Megakaryozytopoese (10) (Abbildung 1A). Einmal begangen, Vorläufer jeder Linie exprimieren Zelloberflächenmarker, die verwendet werden können, um ihre zunehmend eingeschränkte schrittweise Progression in reife Phänotypen zu identifizieren. Von diesen Linien ist die Myelopoese wohl die komplexeste in Bezug auf die Vielfalt der vollständig differenzierten Phänotypen, die sie hervorbringen kann, und die zahlreichen Verzweigungspunkte und Teilmengen darin (11). Daher ist die Durchflusszytometrieanalyse eine Hauptstütze bei der Untersuchung der Hämatopoese und insbesondere der Myelopoese.

Analyse von mononukleären Knochenmarkszellen mit diesem OMIP. (A) Ein Beispiel für ein Gating-Schema für gesunde mononukleäre Knochenmarkszellen. Einzelne Zellen wurden unter Verwendung von Parametern für die Vorwärtsstreuhöhe im Vergleich zur Breite, gefolgt von Parametern für die Seitenstreu Höhe im Vergleich zur Breite, gated. Tote Zellen zusammen mit CD3 + – und CD19 + -Zellen wurden vor nachfolgenden Gating-Schemata von der Analyse ausgeschlossen. Gates wurden nach Fluoreszenz platziertminus-ein Grad oder höher. Rote Pfeile = gated Zellen. Römische Zahlenmarkierungen entsprechen dem Schema in Teil B. (B) Eine schematische Übersicht über die wichtigsten hämatopoetischen Linien, die in diesem Panel analysiert wurden. Römische Ziffern zeigen diskrete Phänotypen an. (C) Histogramme mit CD15-, CD32-, CD36- und CD163-Färbung an gesunden mononukleären Knochenmarkszellen (schwarz) und zwei Patienten mit CMML (rot = Patient 1; blau = Patient 2). Die Zellen in Teil C wurden zunächst wie in Teil A auf FSC-versus SSC-Eigenschaften heruntergestuft.

Krebserkrankungen, die aus dem myeloischen Kompartiment entstehen, sind ähnlich komplex und behalten viele der Oberflächenmarker bei, die ihre Ursprungszelltypen widerspiegeln, sowie eine abweichende Expression anderer myeloischer Marker oder Abstammungstypen (1, 2). Immunphänotypisierung MNs ist wichtig für die Diagnose, und insbesondere ist entscheidend für die Stratifizierung von myeloischen und lymphatischen Leukämien, die deutlich verwaltet werden. MNs, einschließlich der myelodysplastischen Syndrome (MDS), sind eine heterogene Gruppe von Krankheiten mit erhöhtem Risiko der Umwandlung in akute myeloische Leukämie (AML) und schlechte Überlebensraten(2).

Die Beurteilung des MNs beruht weitgehend auf der morphologischen Beurteilung des Knochenmarkaspirats, und eine Reihe von Durchflusszytometrie-Panels mit niedrigeren Parametern werden parallel oder nacheinander durchgeführt (3, 4). Solche Panels wurden erstmals 2008 vom International Workshop on Standardization of Flow Cytometry in MDS als standardisiertes Set skizziert. Ein beispielhaftes Screening würde zehn Vierfarbfelder umfassen, von denen jedes CD45 enthält, von denen sieben die Vorläufermarker CD34 und / oder CD117 enthalten würden, von denen fünf eine Kombination von myeloischen Markern wie CD33, HLA-DR, CD13, CD36, CD64 und / oder CD11b enthalten würden. Die verbleibenden Parameter wurden von den Abstammungsmarkern CD2, CD5, CD7, CD10, CD19, CD14, CD15, CD16, CD56 belegt, und / oder CD71, so dass sich jede Röhre auf bestimmte Krankheitsteilmengen konzentriert (3). In jüngerer Zeit hat das EuroFlow-Konsortium eine Reihe von Panels vorgeschlagen, die schrittweise durchgeführt werden, beginnend mit einem von mehreren Screening-Panels, die ausgewählt werden basierend auf klinischen oder Laborindikationen. In Bezug auf MNs würden sich die Ergebnisse dieses ersten Screening-Panels jeweils an einem von drei umfassenderen Panel-Sets orientieren, die sich auf B-Zell-Vorläufer, akute lymphoblastische Leukämie oder AML / MDS-Krankheitsteilmengen unter Verwendung von Markern konzentrieren, die mit B-Zellen, T-Zellen oder myeloischen Zellen assoziiert sind. Unter Berücksichtigung des AML / MDS-Panels zusammen mit dem anfänglichen Screening-Panel umfassen die Empfehlungen des EuroFlow-Konsortiums 36 Marker für MNs-Fälle (4).

Das hier vorgestellte Panel enthält einen Rahmen, der einen breiten Überblick über die Myelopoese von HSC über reife Monozyten- / Makrophagenpopulationen, Myeloid-abgeleitete Suppressorzellen (MDSC) und ein breites Spektrum von MDS / MPN-Krankheitssubtypen (2, 12, 13-15) in einem einzigen 18-Farben-Panel ermöglicht (Tabelle 2). Das Panel wurde konstruiert, indem zuerst die Färbeverdünnung jedes Antikörpers titriert und der optimale Färbungsindex berechnet wurde (ergänzende Abbildungen 1 und 2) und dann schrittweise das Panel basierend auf Kategorieparametersätzen aufgebaut wurde (Tabelle 2), wobei jede Kategorie der Reihe nach hinzugefügt wurde (ergänzende Abbildung 3A-D). Das Panel enthält als Dienstprogramm Anti-CD3 und Anti-CD19, konjugiert an Brilliant Violet® 510 (BV510), die im selben Detektor wie der Lebensfähigkeitsmarker Live / Dead ™ Aqua (ThermoFisher Scientific) von der Analyse ausgeschlossen werden können, und Anti-CD138, um reife Lymphozytenpopulationen und Plasmazellen vor der Analyse hämatopoetischer Populationen auszusortieren. In ähnlicher Weise können erythropoetische und megakaryozytopoetische Linien unter Verwendung von CD71 bzw. CD41a von den myeloischen Linien getrennt werden, und die darin enthaltenen Vorläufer können unter Verwendung von CD117 oder einer Kombination von CD45, CD34 und CD117 identifiziert werden. Innerhalb von CD41a-CD71- Zellen kann nicht gebundenes HSC durch Gating auf CD45 + − oder CD45low-Zellen, gefolgt von CD34 + CD117 + −Zellen und schließlich auf CD33-HLA-DR-Zellen identifiziert werden. Umgekehrt können multipotente Progenitoren (MPP) und gemeinsame myeloische Progenitoren (CMP) von engagierten Monoblasten innerhalb des entsprechenden CD33 + HLA-DR + -Gatters unter Verwendung der CD64-Expression unterschieden werden. Gemeinsame lymphoide Vorläuferzellen (CLP) können als CD34 + CD117− (11) identifiziert werden, obwohl reifere Lymphozytenpopulationen aus der Analyse unter Verwendung von CD3 und CD19 als Teil eines gemeinsamen “Dump Gate” zusammen mit dem Lebensfähigkeitsmarker entfernt werden. Reifere Monozyten- und Granulozytenpopulationen können innerhalb des CD34-Tors analysiert werden. Hier können reife Monozyten durch CD14-Expression identifiziert werden, während Promonozyten nach dem Gating auf CD117-Zellen als CD33 + CD64 + HLA−DR + und CD11c + identifiziert werden können. Die Hierarchie der Granulozytenreifung kann analysiert werden, indem zuerst CD33−CD64−Zellen innerhalb des CD117−Tors und dann die CD16-Expression auf CD11blow-Zellen erhöht werden. Schließlich können voll ausgereifte Neutrophile anhand der SSC- und CD45-Expression von Bandzellen unterschieden werden (Abbildung 1B, ergänzende Tabelle 3). Wichtig ist, dass die hier gefärbten Proben durch Dichtegradientenzentrifugation verarbeitet wurden, um mononukleäre Knochenmarkszellen (BMMNC) zu erhalten, da viele Knochenmarkbiopsien von Patienten durchgeführt werden. Diese Methode ist zwar Standard, schließt jedoch polymorphkernige Zellen wie reife Neutrophile aus. Eine alternative Probenverarbeitung wie die Erythrozytenlyse kann diese Populationen bei Bedarf beibehalten (ergänzende Abbildung 4).

Tabelle 2:

Reagents

Specificity Clone Fluorochrome Purpose Category
CD138 MI15 APC-Cy7 Plasma Cell Utility
CD19 HIB19 BV 510 Dump Utility
CD3 SK7 BV 510 Dump Utility
CD45 HI30 BUV 805 Leukocyte Utility
Live/Dead Aqua Viability Utility
CD117 104D2 BB 515 Progenitor Lineage
CD11b ICRF44 BV 650 Myeloid Lineage Lineage
CD11c 3.9 PE-CF594 Dendritic Cell Lineage
CD14 M5E2 BV 786 Monocyte Lineage
CD16 3G8 BUV 496 FC Receptor Lineage
CD33 WM53 BV 421 Myeloid Lineage Lineage
CD34 581 PE-Cy7 Progenitor Lineage
CD36 CB38 PerCP-Cy5.5 M2 Mak. Teilmenge
CD64 10.1 BUV 737 Aktivierung; M1 Mac. Teilmenge
HLA-DR G46-6 BUV 395 M1 Mak. Teilmenge
CD15 W6D3 AF 700 Myeloische Reifung Krankheit Diff.
CD163 WHI/61 BV 605 Makrophagen Krankheitsunterschied.
CD32 FUN-2 APC FC Receptor Disease Diff.
CD41a HIP8 PE Megakaryocyte Disease Diff.
CD71 M-A712 BV 711 Erythroid Marker Disease Diff.

BUV, Brilliant Ultra Violet™; PE, R-phycoerythrin; BV, Brilliant Violet™; Cy, cyanine; PerCP-Cy5.5, Peridinin-chlorophyll Cy-5.5; APC, allophycocyanin; Mac., macrophage; M1, Typ-I-Makrophagen; M2, Typ-II-Makrophagen; FC, Fragment kristallisierbare Region; Diff, Differenzierung

Zusätzlich zur Klassifizierung normaler hämatopoetischer Linien sind CD15, CD41a und CD71 Schlüsselmarker, die zwischen verschiedenen Arten von MNs unterscheiden können, die in Kombination mit CD32 und CD163 theoretisch zwischen der Mehrheit der MDS-Subtypen und weiteren subfraktionalen Krankheitsteilmengen einschließlich CMML unterscheiden können (Abbildung 1C und ergänzende Abbildungen 6-8) (16-22). Während sich das grundlegende Design dieses Panels auf myeloische Linien konzentriert, könnte die Einbeziehung von CD38 und CD45RA anstelle von krankheitsdifferenzierenden Markern wie CD32 oder CD163 bei der Analyse von Langzeit-HSC- und HSC-Subtypen hilfreich sein (11).

Mit der High-Order-Zytometrie bieten algorithmengeführte Analysen eine umfassendere und objektivere Analysemöglichkeit im Vergleich zu herkömmlichen Gate-basierten Ansätzen, die Vorkenntnisse über zelluläre Phänotypen erfordern. Hier haben wir die Spannbaum-Progressionsanalyse von dichtenormalisierten Ereignissen (SPADE) verwendet, um Zellen basierend auf dem Ausdruck jedes Parameters einem von 200 verschiedenen Knoten zuzuweisen (mit Ausnahme der Speicher- / Dump-, Vorwärtsstreuungs- und Seitenstreuungsparameter) und Diese Knoten dann unter Verwendung eines zuvor beschriebenen hierarchischen Algorithmus (23) zu clustern. Dies führte zu 37 verschiedenen Knotenclustern oder Phänotypen (ergänzende Abbildungen 9 und 10, ergänzende Tabelle 4). Dreißig dieser Phänotypen entsprechen Populationen, die durch Gate-basierte Analyse identifiziert wurden, und in vielen Fällen identifizierten sie weitere Subpopulationen, wie durch ein numerisches Suffix kommentiert (Ergänzende Abbildung 10ergänzende Abbildung 4). SPADE identifizierte auch sieben Phänotypen, die nicht den durch die Gate-basierte Analyse identifizierten Populationen entsprechen. Obwohl hier nicht demonstriert, eignet sich dieses Panel neben SPADE auch für andere algorithmengeführte Analysen, einschließlich t-SNE / viSNE, Wanderlust, FlowSOM oder PhenoGraph (24-26).

Zusammenfassend eignet sich dieses optimierte Panel für die Untersuchung der Hämatopoese mit Schwerpunkt Myelopoese. Da dieses Panel in der Lage ist, Phänotypen über ein breites Spektrum des myeloischen Kompartiments hinweg zu unterscheiden, kann es zahlreiche MPNs charakterisieren und theoretisch einen großen Teil der MDS-Subtypen, einschließlich CMML, unterscheiden. Es hat auch das Potenzial, die Untersuchung von MPNs zu unterstützen, indem es Krankheitsteilmengen weiter stratifiziert oder darin neuartige Biomarkerkombinationen definiert, insbesondere in Kombination mit algorithmusgesteuerten Analysen wie SPADE.

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